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三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)檢測利福平和利福噴丁中兩種亞硝胺雜質(zhì)含量

方案概述

前言：

亞硝胺雜質(zhì)是指一類常見的有機化合物，其結(jié)構(gòu)中含有一個或多個亞硝基（-NO）基團。亞硝胺雜質(zhì)通常在食品、飲料、藥品以及化妝品等產(chǎn)品中存在。它們是由于食品加工過程中，其中含有的亞硝酸鹽與氨基化合物（如氨基酸和蛋白質(zhì)）反應生成的。亞硝胺雜質(zhì)被認為具有潛在的致癌和致突變作用，因此對其進行監(jiān)測和控制至關(guān)重要。根據(jù)亞硝胺結(jié)構(gòu)可以將亞硝胺分為兩類，一類是小分子亞硝胺如NDMA、NDEA等，另外一類是NDSRIs（藥物成分相關(guān)亞硝胺），其與API結(jié)構(gòu)相似或相關(guān)，由API或其片段中的胺基與物料中亞硝化試劑（如亞硝酸鹽）反應生成。

利福平與利福噴丁均為治療結(jié)核最常見的藥物之一，其利福平合成路徑中產(chǎn)生的與API片段相似的1-甲基-4-亞硝基哌嗪（MNP）與利福噴丁合成路徑中產(chǎn)生的1-環(huán)戊基-4-亞硝基哌嗪均為亞硝胺雜質(zhì)。

本方法通過皖儀科技LC-MS TQ9200三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)檢測利福平與利福噴丁中MNP與CPNP，其中，MNP與CPNP線性范圍均大于0-100 ng/mL，0.1 ng/mL信噪比均大于10，滿足實驗要求，完全適用于高效快速準確地檢測利福平與利福噴丁中的MNP與CPNP含量。

關(guān)鍵詞：液質(zhì)聯(lián)用；亞硝胺雜質(zhì)；利福平、利福噴丁。

1.儀器配置

表1 儀器配置清單

儀器	數(shù)量
皖儀LC3600系列高效液相色譜	1
皖儀TQ9200系列三重四極桿質(zhì)譜儀	1
渦旋混勻器	1
離心機	1

2.儀器方法

2.1 液相條件

色譜柱：phenomenex Kinetex F5 2.6 μm，3x100 mm

流動相：A相：甲醇

B相：水

流速：0.3 mL/min

柱溫：40 ℃

進樣體積：5 μL

2.2 質(zhì)譜條件

本方法使用電噴霧離子源，離子源電壓為5500 V，脫溶劑氣流量為17000 mL/min，脫溶劑氣溫度為450 ℃，霧化氣流量為2000 mL/min，氣簾氣流量為8000 mL/min，氣簾氣溫度為150 ℃，碰撞氣流量為800 μL/min。

2.3 化合物參數(shù)

表2 質(zhì)譜化合物參數(shù)

化合物名稱	掃描模式	前體離子	產(chǎn)物離子	DP（V）	CE（eV）	CXP（V）
MNP	+	130.2	100.2	48	12	11
MNP	+	130.2	58.1*	48	22	11
CPNP	+	184.3	154.3	30	12	11
CPNP	+	184.3	98.3*	30	18	11

注：帶*為定量離子

3.方法學驗證

3.1 實驗結(jié)果

9.5分鐘內(nèi)完成利福平與利福噴丁中MNP與CPNP的測定，化合物均有良好的峰形，無常見的峰形拖尾現(xiàn)象，化合物響應良好，符合實驗測定需求。

圖1 實驗結(jié)果總圖

3.2 標準曲線

精確配制100 μg/mL MNP與CPNP混標，稀釋至0.2μg/mL，逐級稀釋為200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL。

表2 標準曲線及線性范圍

化合物	線性方程	R2	線性范圍( ng/mL)
MNP	Y=125306.43*X+730.35	0.999 82	0-200
CPNP	Y=559701.56*X-13894.98	0.999 50	0-100

圖2 MNP標準曲線圖3 CPNP標準曲線

3.3 精密度

連續(xù)進樣6針0.5 ng/mL、5 ng/mL、50 ng/mL分別檢測該線性在低中高不同濃度的重復性，RSD小于3%，符合要求。

表2 精密度數(shù)據(jù)結(jié)果

濃度( ng/mL)	MNP	CPNP
濃度( ng/mL)	RSD(%,n=6)	RSD(%,n=6)
0.5	2.364	2.423
5	2.893	1.425
50	2.904	0.932

圖4 MNP 6針重復性色譜圖圖5 CPNP 6針重復性色譜圖

3.4 靈敏度

使用峰到峰方式計算0.1 ng/mL MNP信噪比為19.674，0.1 ng/mL CPNP信噪比為47.964，均大于10，符合要求。

表5 靈敏度數(shù)據(jù)結(jié)果

化合物	0.1 ng/mL信噪比
MNP	19.674
CPNP	47.964

圖6 0.1 ng/mL色譜圖

3.5 樣品檢測

取利福平與利福噴丁膠囊內(nèi)容物配置成樣品溶液，稀釋后進液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)分析，實驗結(jié)果如下：

表6 樣品含量檢測結(jié)果

化合物	樣品量( ng/mL)	RSD(%,n=3)
MNP	0.052	6.480
CPNP	0.137	2.120

圖7 利福平中的MNP色譜圖

圖8 利福噴丁中的CPNP色譜圖

在FDA公布的含有亞硝胺雜質(zhì)的藥物中，MNP與CPNP限值均為400 ng/day，其成人每日最大攝入量為300 mg。將利福平和利福噴丁處理完成的上清液進液質(zhì)檢測以后發(fā)現(xiàn)利福平溶出液中含有MNP含量為0.052 ng/mL；利福噴丁溶出液中CPNP含量為0.137 ng/mL，而假設每天攝入300 mg藥物，則MNP攝入量為15.6 ng/day，CPNP攝入量為41.1 ng/day，均小于FDA規(guī)定的限值。

4.結(jié)論

經(jīng)過以上內(nèi)容的驗證，說明本方法適用于檢測利福平與利福噴丁中的MNP與CPNP，其中，MNP與CPNP線性范圍均大于0-100 ng/mL，0.1 ng/mL信噪比均大于10，滿足實驗要求，完全適用于高效快速準確地檢測利福平與利福噴丁中的MNP與CPNP含量。

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